2024年4月7日，我院天然药物及仿生药物全国重点实验室马明团队在国际著名期刊Angew. Chem. Int. Ed.上发表了题为“Structural Insights into the Terpene Cyclization Domains of Two Fungal Sesterterpene Synthases and Enzymatic Engineering for Sesterterpene Diversification”的研究论文。该研究首次揭示了真菌中二倍半萜环化酶的晶体结构，并通过酶的改造产生新颖二倍半萜化合物。
二倍半萜是萜类家族中一类化学结构多样、生物活性显著的天然产物，它们25个碳原子的化学骨架由二倍半萜环化酶催化产生。目前一个有意思且令人困惑的现象是：在整个萜类家族发现的~95000个化合物中，二倍半萜只有~1500个（占1.6%），其数量大大少于其它萜类化合物（比如二萜类有~18000个）。这种数量上的缺少是否归因于（或者部分归因于）自然界中二倍半萜环化酶催化的产物骨架少？回答该问题需要对二倍半萜环化酶的结构和催化机制进行研究。然而，目前只有一个植物来源（拟南芥）二倍半萜环化酶结构被解析，占已知二倍半萜环化酶总数74%的真菌来源二倍半萜环化酶尚无结构研究的报道。
图1. 真菌二倍半萜环化酶NfSS和PbSS催化的反应及其包含的双功能域
基于此，研究团队针对两种真菌来源二倍半萜环化酶NfSS和PbSS开展了研究。这两个酶都是双功能酶（真菌二倍半萜环化酶的共性特征），它们的C端是异戊二烯转移酶功能域（PT），负责催化DMAPP和IPP产生链状C25底物GFPP；N端是环化功能域（TC），负责将GFPP分别环化成二倍半萜化合物sesterfisherol (1)和sesterbrasiliatriene (2)（图1）。由于只有TC功能域负责环化反应，因此本研究解析了NfSS-TC和PbSS-TC这两个功能域的晶体结构。晶体结构显示NfSS-TC和PbSS-TC含有I型萜类环化酶典型的α-螺旋集束结构和Mg2+结合的保守基序，同时结构中均包含Mg2+、焦磷酸PPi和BTAC（模拟催化反应中的碳正离子）（图2）。通过对结构和活性口袋的分析，确定了参与催化反应的关键氨基酸残基。
图2. NfSS-TC和PbSS-TC的晶体结构和活性口袋
研究团队进一步通过2H和13C同位素标记实验确证了NfSS-TC催化GFPP历经10个碳正离子中间体形成产物sesterfisherol (1)的环化机制，基于NfSS-TC的晶体结构进行分子对接探讨了活性口袋氨基酸与碳正离子中间体的相互作用，通过对活性口袋氨基酸的定点突变改变催化路径，产生了一系列结构各异的二倍半萜化合物（3–14）（图3）。运用同样的策略，对PbSS-TC活性口袋氨基酸定点突变构建酶突变体，这些突变体产生了二倍半萜化合物（15–22）。经过大规模发酵和色谱分离，通过波谱学方法共鉴定了20个二倍半萜（3–22），其中有13个新化合物，涵盖单环到五元环等不同类型的环系结构，扩展了二倍半萜化合物的结构多样性（图3）。
图3. NfSS-TC和PbSS-TC突变体的催化产物
所得的20个化合物中包含四对C18位构型不同的差向异构体（2/17, 3/4, 5/18, 6/22）（图3），通过分析发现，NfSST88A突变体可以产生与野生型NfSS在C18位构型相反的化合物3，而PbSSI325A突变体可以产生与野生型PbSS在C18位构型相反的化合物17。通过分析发现T88和I325分别在两个酶的活性口袋中起到对碳正离子中间体的积压作用，保证碳正离子中间体形成特定C18构型的环化产物。如果将这两个氨基酸突变为侧链较小的丙氨酸，导致挤压作用减弱，则可产生C18构型相反的环化产物。
另外，所得倍半萜产物主要为双键位置不同的化合物（图3），而不是本研究团队前期改造倍半萜环化酶（J. Am. Chem. Soc. 2023, 145, 8474-8485.）和二萜环化酶（Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202209785.）时产生的碳骨架重排化合物。计算分析显示NfSS-TC和PbSS-TC活性口袋的体积要大于代表性倍半萜环化酶和二萜环化酶的活性口袋体积，推测它们较大的活性口袋导致氨基酸残基难以接近并稳定碳骨架重排中的碳正离子，这可能是导致产物骨架多样性差的部分原因。综上所述，本研究首次阐明了真菌来源两个二倍半萜环化酶催化反应的结构基础，发现了影响产物C18立体构型的关键氨基酸，并探讨了两个酶产生骨架重排产物少的原因，为利用酶法制备更多二倍半萜化合物提供了有益参考。
北京大学药学院硕士生徐萌、雷阵宇，德国波恩大学博士生Houchao Xu为本论文共同第一作者。北京大学药学院马明研究员、杨东辉研究员、波恩大学Jeroen S. Dickschat教授为共同通讯作者。该工作得到天然药物及仿生药物全国重点实验室仪器平台的尹富玲/贾红丽（X-射线晶体衍射测试）、李勤/刘芬（核磁共振测试）、陶海燕/陈卫（气相-质谱测试）等老师的大力支持。
原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202405140
通讯作者简介：
马明，北京大学博雅特聘教授，国家杰出青年科学基金获得者，北京大学药学院、天然药物及仿生药物全国重点实验室研究员，博士生导师。研究领域为天然药用分子的发现和生物合成。近5年以通讯作者在JACS、Angew Chem Int Ed、ACS Catal、Chem Sci、Acta Pharm Sin B等国际学术期刊发表SCI论文21篇。任中国药学会海洋药物专业委员会委员、中国植物学会植物化学与资源专业委员会委员、中华中医药学会青年委员会委员、北京药学会天然药物专业委员会委员、国际期刊Chinese Journal of Natural Medicines编委会委员。
杨东辉，北京大学药学院研究员。研究方向为天然药源分子的发现、生物合成与生物转化。以通讯作者在JACS、Angew Chem Int Ed、Commun Chem、Org Lett、J Org Chem、J Nat Prod等本领域权威期刊发表学术论文30篇。担任世中联中药化学专业委员会常务理事、中西医结合学会分子生药学专业委员会委员、中国民族医药学会药用资源委员会理事。
天然药物及仿生药物全国重点实验室 供稿
